En kofaktor er en ikke-protein kjemisk substans bundet til et protein og nødvendig for proteinets biologiske aktivitet, noe som må være tilgjengelig i tillegg til enzym for å katalysere en gitt reaksjon. Mer eller mindre universelle substanser som vann faller ikke under begrepet. Kofaktoren utgjør ofte en del av det aktive setet.

Noen kofaktorer er uorganiske, som metallatomene til sink, jern og kobber i enkelte former. Andre, som lipid, sukker og de fleste vitaminer, er organiske. Kofaktorer kan også klassifiseres avhengig av hvor tett bundet de binder til et enzym, hvor løst bundet kofaktorer kalles koenzymer, og tett bundet kofaktorer kalles prostetiske grupper. Et eksempel på en protetisk gruppe er hemgruppen i hemoglobin. Et inaktivt enzym, uten kofaktor, kalles et apoenzym, og et komplett enzym med kofaktor kalles holoenzym.

Noen kofaktorer får en kjemisk endring under reaksjonen de er del i, slik som oksidering eller reduksjon. Men, som katalysator, vil kofaktorer alltid returnere til originalforbindelsen når reaksjonen er over. De blir ikke forbrukt i reaksjonen, eller endret til andre forbindelser.